近日，华南师范大学环境学院应光国教授、赵建亮研究员团队2021级硕士研究生张源源等人在《Environment Pollution》上发表了题为“In vitro metabolism of the emerging contaminant 6PPD-quinone in human and rat liver microsomes: Kinetics, pathways, and mechanism”的论文（DOI: 10.1016/j.envpol.2024.123514）。该研究以肝微粒体体外代谢反应体系探究了轮胎添加剂的抗氧化剂6PPD及其转化产物6PPD醌（6PPD-Q）的I相代谢情况，通过疑似筛查和非靶向的分析方法阐明了可能的转化产物及转化路径，结合表型分析实验与分子对接明确了代谢6PPD-Q的关键作用酶。
图文摘要
全文速览
本研究重点探究了6PPD-Q在人/大鼠肝微粒体中的体外代谢情况。当暴露浓度为4 μg·L−1时，6PPD-Q在肝微粒体中的代谢程度达90%以上。随着暴露浓度的增加，肝微粒体酶活性受到抑制，代谢程度明显降低。相较于6PPD-Q，6PPD的代谢清除程度不会随暴露浓度的增大而降低，在8和40 μg·L−1的暴露条件下代谢清除程度均能达到90%以上。人肝和大鼠肝微粒体中6PPD-Q的CLint值分别为21.10和18.58 μL·min−1·mg−1蛋白，相较于其他已报道的污染物代谢潜力较低。检测到七种6PPD-Q的I相代谢产物和一种中间体。单加氧和双加氧的反应是主要的I相代谢途径。CYP1A2、3A4和2C19是人肝微粒体代谢6PPD-Q 的关键作用酶。6PPD-Q被大鼠肝微粒体广泛代谢。毒性预测结果表明母体化合物6PPD-Q相对安全，某些I相代谢产物似乎具有致突变性或免疫毒性。
引言
发表于《Science》上论文报道了6PPD-Q对银鲑鱼的急性致死效应，引起了世界范围的广泛关注，轮胎添加剂的安全性备受质疑。6PPD-Q是橡胶抗氧化剂6PPD经臭氧氧化的转化产物，广泛存在于各种环境介质中，可通过吸入、食入和皮肤接触等多种途径进入人体，进而进一步进入人体的代谢系统。本研究以肝微粒体体外孵育体系探究6PPD和6PPD-Q的生物转化情况，探讨6PPD-Q对人体健康可能的影响。
图文导读
代谢过程遵循一级动力学。人肝微粒体孵育体系中，4、16或80 μg·L−1的暴露浓度条件下，6PPD-Q的t1/2分别为10.7、29.6或253.9 min；大鼠肝微粒体孵育体系中，4、16或80 μg·L−1的暴露浓度条件下，6PPD-Q的t1/2分别为16.6、30.6或172.9 min。80 μg·L−1暴露浓度条件下，6PPD-Q在两种肝微粒体孵育体系中的t1/2均显着延长，并且超过了120 min的孵育时间。理论上，一级动力学过程的t1/2与底物浓度无关。但6PPD-Q的t1/2随着暴露浓度的增加而增加，表明肝微粒体的酶活性可能被6PPD-Q抑制。6PPD-Q对人体肝脏潜在的毒性作用非常值得关注。
Fig. 1. Substrate depletion curve of 6PPD-Q in human (a) and rat (b) liver microsomes. When the exposure concentration of 6PPD-Q is 4 μg·L−1, the reaction ends at 60 min (there is no significant difference among the groups of 60, 90, and 120 min, p < 0.05). When it is 80 μg·L−1, the metabolism ends at 90 min (there is no significant difference between 90 and 120 min groups, p < 0.05). Data are means ± standard derivations (n = 4).
6PPD-Q在人和大鼠肝微粒体孵育体系中代谢动力学参数Km和Vmax在0.8–160 μg·L−1浓度范围内通过Michaelis-Menten方程拟合当底物饱和时，人肝微粒体孵育体系中的酶反应速率较高（Vmax, human > Vmax, rat）。 大鼠肝微粒体孵育体系中Vmax相对较低，但Km也相对较低，因此两种肝微粒体孵育体系得到了类似的CLint（CLint, human，21.10 μL·min−1·mg−1 蛋白；CLint, rat ，18.58 μL·min−1·mg−1 蛋白）。CLint是酶代谢特定化合物的活性指标，这意味着人和大鼠具有相似的6PPD-Q代谢能力。
Fig. 2. Enzyme kinetics of 6PPD-Q in human (a) and rat (b) liver microsomes fitted to Michaelis–Menten model. Data are means ± standard derivations (n = 4).
通过疑似筛查和非靶向的分析方法获得了七种Ⅰ相代谢产物（M1–M7）和一种代谢中间体（M8），并初步解析了关键代谢产物的结构，归纳了体外肝微粒体代谢的生物转化途径。
Fig. 3. Possible metabolic pathways of 6PPD-Q. Dotted arrow: it is not entirely certain whether M5 is the product of further oxidation of M1 or M4.
结合酶抑制实验与分子对接计算的结果，CYP1A2、3A4和2C19是人肝微粒体代谢6PPD-Q 的关键作用酶。6PPD-Q被大鼠肝微粒体广泛代谢。
Fig. 4. The extent of 6PPD-Q metabolism in human (a) and rat (b) liver microsome metabolic system with different concentrations by different inhibitors. Data are means ± standard derivations (n = 4). Different lowercase letters indicate a statistical significance of p < 0.05 (ANOVA), different uppercase letters indicate a statistical significance of p < 0.01 (ANOVA). SUL, sulfaphenazole; ANF, α‑naphthoflavone; DDC, diethyldithiocarbamate; KTZ, ketoconazole; QUI, quinidine.
Fig. 5. Molecular docking analysis of human isoforms CYP1A2 (a), CYP3A4 (b), and CYP2C19 (c) binding with 6PPD-Q. Van der Waals, pi–pi stacked, pi–sigma, and hydrogen bond forces contributed to the interaction between the receptor and 6PPD-Q.
结论与研究意义
研究结果表明研究6PPD-Q 在较低浓度下代谢显著，但在高浓度下代谢程度降低。关键I 相代谢产物为单加氧和进一步氧化的产物。与6PPD相比，6PPD-Q所需的代谢时间相对较长，代谢40 μg/L 6PPD的半衰期（t1/2）为28.9 min，而代谢16 μg/L 6PPD-Q的 t1/2则需要29.6 min，代谢80 μg/L 6PPD-Q的 t1/2则要达到254 min。这也说明与轮胎添加剂母体相比，转化产物更难被人体所代谢，可能带来更大的环境健康问题。未来的研究应重点关注轮胎添加剂转化产物，特别是其他PPD-Qs的转化产物，以充分评估其对人类健康的影响。
致谢
本研究受到国家自然科学基金联合基金重点项目（No. U21A2036）等基金支持。
论文链接：
Zhang, Y.Y., Huang, J.W., Liu, Y.H., Zhang, J.N., Huang, Z., Liu, Y.S., Zhao, J.L., Ying, G.G. In vitro metabolism of the emerging contaminant 6PPD-quinone in human and rat liver microsomes: Kinetics, pathways, and mechanism. Environmental Pollution, 2024, 345, 123514. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2024.123514